技術(shù)交流

狂犬病是危害人類健康的最古老疾病之一，由狂犬病病毒引起，人類患者一旦發(fā)病，病死率幾乎為100%，是迄今為止人類病死率最高的急性傳染病，也是人類尚未能有效控制的疫病之一?？袢∫呙缡穷A防狂犬病唯一有效的方法。歐洲和北美的許多國家已持續(xù)多年無狂犬病發(fā)生，得益于采用狂犬病口服疫苗對野生動物進行誘餌口服免疫。在愛沙尼亞、法國、意大利、瑞士、芬蘭等國家大規(guī)模應用狂犬病口服疫苗后僅幾年就使這些國家消除了狂犬病。對我國2004年至2018年國內(nèi)動物狂犬病病例進行回顧性調(diào)查時發(fā)現(xiàn)，0.33%(33/10118)的犬被確診為狂犬病陽性，陽性犬中29只屬于流浪犬，因此在我國對流浪犬進行狂犬病免疫可有效減少人狂犬病的發(fā)生。由于狂犬病毒的流行面積和宿主范圍非常廣泛，單靠注射免疫很難消滅狂犬病毒，特別是對于城市的流浪動物，用口服疫苗大面積免疫是消滅犬狂犬病的最有效方法。

歐美等發(fā)達國家從1978年就開始大規(guī)模應用減毒活疫苗預防動物狂犬病，并明顯降低了野生動物狂犬病的發(fā)病率，同時也極大減少了被動物致傷發(fā)生的家畜狂犬病和暴露后免疫人數(shù)，最終消除了這些國家的人間狂犬病。早期應用于疫苗的減毒株主要有重組痘病毒V－RG株，和一些不同減毒水平的減毒株，如ERA株、SADBern株、SADB19株和SAD5/88株，雖然這些毒株毒力顯著減弱，但仍然對小鼠和其他野生動物保留殘余毒力，存在傳播感染的危害性。相比之下重組疫苗存在較多的優(yōu)勢，不僅安全可靠，而且可通過口腔、胃腸黏膜進行抗原遞呈，較傳統(tǒng)注射途徑免疫效果好且簡易便捷。表達狂犬病毒糖蛋白重組復制缺陷型人5型腺病毒活載體疫苗rAd5－ΔE1/E3－CGS已被證實能夠產(chǎn)生抗狂犬病毒的保護性抗體，是一種安全、可靠、高效的動物狂犬病候選疫苗，但其穩(wěn)定性受到餌料制備、儲運條件、儲存時間及投放環(huán)境等因素的影響。為探索rAd5－ΔE1/E3－CGS口服疫苗消減規(guī)律，本研究依據(jù)餌料制備、儲存運輸、環(huán)境投放等情況設計方案，選取不同劑型疫苗，經(jīng)儲存運輸、反復凍融、環(huán)境投放不同階段考察疫苗的效價，并進行統(tǒng)計學分析，為rAd5－ΔE1/E3－CGS口服疫苗的劑型研制、儲備運輸、免疫程序提供技術(shù)參考。

1.1疫苗、犬天然誘食劑、口服疫苗佐劑和細胞

rAd5－ΔE1/E3－CGS(農(nóng)基安證字(2020)第202號)由軍事科學院軍事醫(yī)學研究院軍事獸醫(yī)研究所提供；犬天然誘食劑由上海諾倫生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司提供；口服疫苗佐劑由上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所提供；293A細胞購自商城北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM細胞培養(yǎng)液(批號：2126865)、0.25%濃度胰酶消化液(批號：2142303)均購自GIBCO公司；胎牛血清(批號：2418)購自SIGMA公司；96孔細胞培養(yǎng)板(批號：25200601)購自美國Costar公司。

1.3 口服疫苗制備(見表1)

1.3.1 rAd5－ΔE1/E3－CGSTCID₅₀測定

rAd5－ΔE1/E3－CGS同步接種293A細胞，置37℃含5%CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)48~72h，待80%細胞出現(xiàn)聚集、圓縮、脫落等細胞病變，將培養(yǎng)液凍融三次，2000r/min離心5min，取上清備用，同時按照Reed－Muench法測定TCID₅₀。

1.3.2 口服疫苗凍干劑制備

將疫苗稀釋至1.0×10⁸TCID₅₀/mL，加入等體積的脫脂奶溶液(0.1g/mL)，按照2mL/頭份進行分裝，真空、凍干，－20℃保存?zhèn)溆茫恢芤院鬁y定其TCID50。

1.3.3 口服疫苗咀嚼劑制備

將疫苗稀釋至1.0×108TCID50/mL，每頭份咀嚼劑取1mL病毒液、1mL工作濃度佐劑加入到10g犬天然誘食劑中，充分混勻，用模具壓制成骨型，真空、凍干，－20℃保存?zhèn)溆?，一周以后測定其TCID₅₀。

1.3.4 口服疫苗噴劑制備

將疫苗稀釋至1.0×108TCID50/mL，每頭份取1mL病毒液、1mL工作濃度佐劑和1mL脫脂奶溶液(0.1g/mL)充分混勻，真空、凍干，－20℃保存?zhèn)溆?，一周以后測定其TCID₅₀。

1.4運輸穩(wěn)定性試驗

三種劑型口服疫苗在野外投放前主要通過低溫冷鏈運輸，按照最遠距離計算從出庫至各區(qū)疫控中心，再到各免疫點，最后到達投放點時間不超過48h。分別將三種劑型口服疫苗置2~8℃冷藏車內(nèi)進行48h的運輸，期間模擬10次開門卸貨入庫，每次各取1頭份口服疫苗測定其TCID50。待口服疫苗返回后入庫儲存于－20℃備用，分別于入庫后第3、6、9和12個月測定口服疫苗效價。以儲存于－20℃未經(jīng)運輸?shù)膶诜呙缱鳛閷φ找呙纭?/span>

1.5反復凍融穩(wěn)定性試驗

將通過運輸后重新入庫的備用疫苗室溫放置12h后，再將其回置－20℃冷凍12h，反復5次，每次取1頭份測定其TCID50，剩余疫苗重新入庫于－20℃以下儲存。以儲存于－20℃未經(jīng)凍融的疫苗作為對照疫苗。

1.6不同保存溫度下的穩(wěn)定性試驗

將反復凍融后重新入庫的備用疫苗分別于2~8℃保存4個月，每隔1個月取樣檢測疫苗效價；于15℃放置1個月，每周取樣檢測疫苗效價；于25℃放置1周，每天取樣檢測疫苗效價；于37℃放置3d，每12h取樣檢測疫苗效價。均以各溫度下0時間點的疫苗作為對照。1.7統(tǒng)計學分析疫苗效價檢測結(jié)果均采用lgTCID₅₀/頭份，保留小數(shù)點后2位。用SPSSstatistics軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計及分析，采用單因素方差分析(F)對不同條件下的疫苗進行病毒滴度比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2.1運輸穩(wěn)定性

結(jié)果見圖1。三種劑型口服疫苗經(jīng)過48h運輸和開門卸貨后，凍干劑效價下降了1.42，咀嚼劑下降了1.00，噴劑下降了1.25，但是三種劑型口服疫苗效價均能達到5.75以上。經(jīng)統(tǒng)計學分析，在不同開門卸貨次數(shù)條件下，咀嚼劑相比凍干劑效價差異顯著，具有統(tǒng)計學意義(F_咀嚼劑＝14.810，P＜0.05)；噴劑相比凍干劑也同樣差異顯著，具有統(tǒng)計學意義(F_噴劑＝29.133，P＜0.05)。咀嚼劑、噴劑相對凍干劑效價下降差異顯著，具有統(tǒng)計學意義(F_咀嚼劑＝10.529，F_噴劑＝19.803，P＜0.05)。

運輸后入庫的口服疫苗于－20℃儲存3、6、9、12個月的效價變化見圖2。運輸后－20℃儲存，凍干劑疫苗效價下降了0.58，咀嚼劑下降了0.42，噴劑下降了0.92，但是均能達到5.33以上。經(jīng)統(tǒng)計學分析，在不同時間點條件下，凍干劑、咀嚼劑和噴劑相對對照疫苗效價均差異不顯著，無統(tǒng)計學意義(F_凍干劑＝17.488，F_咀嚼劑＝9.418，F_噴劑＝73.846，P＞0.05)；咀嚼劑、噴劑相對凍干劑效價下降差異同樣不顯著，無統(tǒng)計學意義(F_咀嚼劑＝2.293，F_噴劑＝2.293，P＞0.05)。

2.2 反復凍融穩(wěn)定性

運輸后重新入庫的疫苗反復凍融5次后其效價變化見圖3。凍融后，凍干劑效價下降了0.92，咀嚼劑下降了0.75，噴劑下降了0.58，但是均能達到5.00以上。經(jīng)統(tǒng)計學分析，凍融后，咀嚼劑、噴劑相對凍干劑效價差異不顯著，無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；咀嚼劑、噴劑相對凍干劑效價下降差異顯著，具有統(tǒng)計學意義(F咀嚼劑＝10.529，F噴劑＝19.803，P＜0.05)。

2.3 不同保存溫度下疫苗的穩(wěn)定性

結(jié)果見圖4。

2.3.1 2~8℃保存4個月

凍干劑效價下降了0.33，咀嚼劑下降了0.67，噴劑下降了0.67，但是均能達到5.00以上。經(jīng)統(tǒng)計學分析，凍干劑、咀嚼劑相對對照疫苗效價差異不顯著，無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；但是噴劑相對對照疫苗效價差異顯著，有統(tǒng)計學意義(F_噴劑＝22.894，P＜0.05)；咀嚼劑、噴劑相對凍干劑效價下降差異不顯著，無統(tǒng)計學意義(F_咀嚼＝0.982，F_噴劑＝1.549，P＞0.05)。

2.3.2 15℃保存1個月

凍干劑效價下降了1.58，咀嚼劑下降了0.75，噴劑下降了1.34，疫苗效價最低只有3.75。凍干劑、咀嚼劑和噴劑相對對照疫苗效價差異均不顯著，無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；咀嚼劑、噴劑相對凍干劑效價下降差異也不顯著，無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

2.3.3 25℃保存1周

凍干劑效價下降了2.66，咀嚼劑下降了2.50，噴劑下降了3.34，疫苗效價最低只有2.50。凍干劑、咀嚼劑和噴劑相對對照疫苗效價差異均不顯著，無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；咀嚼劑、噴劑相對凍干劑效價下降差異也不顯著，無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

2.3.4 37℃保存3d

凍干劑效價下降了3.66，咀嚼劑下降了4.00，噴劑下降了3.67，疫苗效價最低只有1.00。凍干劑、咀嚼劑和噴劑相對對照疫苗效價差異均不顯著，無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；咀嚼劑、噴劑相對凍干劑效價下降差異也不顯著，無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

腺病毒作為基因傳遞和表達的有效工具滿足了作為重組疫苗載體的諸多條件，目前已經(jīng)大量的用于疫苗的研發(fā)和臨床基因治療領域，其中研究應用最廣泛的為人5型腺病毒。rAd5－ΔE1/E3－CGS屬于表達狂犬病病毒糖蛋白基因RABV－G的重組復制缺陷型人5型腺病毒活載體疫苗，不僅可以高效表達狂犬病病毒G蛋白，而且其自身的復制缺陷也增加了口服疫苗的安全性，并獲得了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書。由于口服疫苗對冷鏈溫度偏移十分敏感，因此在制備、儲存、運輸、投放過程中的溫度和時間控制尤為重要，高溫影響疫苗效價，或?qū)е陆臃N無效；低溫可影響疫苗形態(tài)，直接影響疫苗的安全性和穩(wěn)定性，且形態(tài)變化多是不可逆的，因此在口服疫苗投放使用前，應當對口服疫苗在實際儲運和環(huán)境釋放中疫苗效價的消減規(guī)律進行研究。

狂犬病口服疫苗rAd5－ΔE1/E3－CGS在被制備成三種劑型后，效價均有所下降，其中咀嚼劑下降最多，達到1.25，可能與犬天然誘食劑中未添加脫脂奶，凍干后保護能力差有關(guān)。在冷鏈運輸和開門卸貨后，雖然相對凍干劑，咀嚼劑和噴劑效價差異顯著，但是效價下降差異并不顯著，疫苗效價仍然保持在最低5.75以上，證明冷鏈運輸中三種劑型口服疫苗均較穩(wěn)定。運輸后儲存于－20℃保存1年，三種劑型口服疫苗效價下降最高不超過1.00，最低疫苗效價仍可以達到5.33以上，因此通過運輸后進入免疫點－20℃保存的口服疫苗保存期至少可以達到1年。儲存于免疫點的口服疫苗投放前會經(jīng)過反復凍融，凍融5次后效價最高下降了0.92，疫苗效價最低仍可達5.00，凍干劑、咀嚼劑和噴劑相對對照疫苗效價差異不顯著，但是咀嚼劑和噴劑相對凍干劑疫苗效價下降差異顯著，說明三種劑型口服疫苗對凍融都具有較強的抵抗力，其中咀嚼劑抵抗凍融的效果最佳，說明野外投放的口服疫苗短暫失溫并不影響疫苗的效價。

活疫苗效價的下降值與保存時間呈正比關(guān)系，但是保存的溫度直接影響疫苗效價的下降率。2~8℃為口服疫苗的暫存溫度，在保存4個月后，疫苗效價最多也只下降了0.67，效價均在5.00以上，說明凍干更有利于口服疫苗的保存，從而保證口服疫苗在冷藏情況下短期保存并不影響它的效價。15℃是疫苗野外投放的平均溫度，咀嚼劑在保存2周后，疫苗效價仍然能夠達到4.67，說明咀嚼劑在野外投放溫度不超過15℃的情況下，其投放的有效時間可達2周。25℃和37℃情況下疫苗效價下降非?？?，且溫度越高，效價下降越快，差異越不明顯，這與Shrivastava等人研究結(jié)果一致，因此高溫季節(jié)不建議進行狂犬病口服疫苗的野外投放。

國內(nèi)流浪犬貓狂犬病口服疫苗免疫尚處于探索階段，rAd5－ΔE1/E3－CGS已被證明能產(chǎn)生較好的中和抗體，雖然目前病毒滴度還夠高，不能滿足大規(guī)模的臨床應用，但梁武等人采用細胞微載體懸浮培養(yǎng)工藝實現(xiàn)了PCV2的量產(chǎn)，為優(yōu)化rAd5ΔE1/E3CGS培養(yǎng)條件、提高病毒滴度、逐步實現(xiàn)其量產(chǎn)提供了研究思路。本研究為狂犬病rAd5－ΔE1/E3－CGS口服疫苗的野外釋放提供了數(shù)據(jù)支撐，也為流浪動物和野生動物的狂犬病疫苗口服免疫提供了技術(shù)支持。

參考文獻：略

來源：中國獸藥雜志2023年4月第57卷第4期