科研動態(tài)

2023年12月12日，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)公共衛(wèi)生安全全國重點實驗室和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物流行病學(xué)重點實驗室楊漢春教授團(tuán)隊在《自噬(Autophagy)》雜志發(fā)表題為"Senecavirus A induces mitophagy to promote self-replication through direct interaction of 2C protein with K27-linked ubiquitinated TUFM catalyzed by RNF185《塞內(nèi)卡病毒A型通過2C蛋白與RNF185催化的K27鏈泛素化的TUFM直接相互作用誘導(dǎo)線粒體自噬促進(jìn)病毒復(fù)制》"的研究論文。該研究豐富了對SVA致病機制的認(rèn)識，并為新型抗病毒策略設(shè)計提供了線索。

論文對塞內(nèi)卡病毒A型（Senecavirus A，SVA）感染誘導(dǎo)宿主細(xì)胞線粒體自噬的分子機制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)SVA的2C蛋白通過與線粒體TUFM蛋白直接相互作用而錨定在線粒體上，并在E3泛素連接酶RNF185催化下TUFM發(fā)生K27連接的泛素化修飾，進(jìn)而被SQSTM1識別并結(jié)合，而SQSTM1又通過與LC3相互作用，將2C錨定的線粒體包裹進(jìn)線粒體自噬體中，實現(xiàn)完全的線粒體自噬，借此促進(jìn)SVA在宿主細(xì)胞中復(fù)制。研究結(jié)果豐富了對SVA致病機制的認(rèn)知，也為基于調(diào)控宿主與病毒相互作用設(shè)計新型抗病毒策略提供了新思路和新靶標(biāo)。

SVA是一種新發(fā)對豬致病的病原，可引起不同年齡段豬口、鼻及蹄部產(chǎn)生水皰、潰瘍以及新生仔豬急性死亡，對全球養(yǎng)豬業(yè)造成了較大威脅。在分類上，SVA屬于微RNA病毒科塞內(nèi)卡病毒屬，其基因組為單股正鏈RNA，全長約7.3kb，編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3和VP4以及非結(jié)構(gòu)蛋白L、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D。作為豬的新發(fā)病原，SVA的致病機理和免疫調(diào)控機制等科學(xué)問題亟待解答，開展此類研究有助于創(chuàng)新SVA感染的防控策略，也為其他動物病原的研究提供參考。

作者利用透射電鏡、激光共聚焦免疫熒光、Western blot和線粒體分離等技術(shù)證實，SVA感染能夠誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生完全線粒體自噬（圖1），并且SVA誘導(dǎo)線粒體自噬依賴于病毒復(fù)制。

圖1. SVA感染誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生線粒體自噬現(xiàn)象

通過對SVA各蛋白進(jìn)行異位表達(dá)，并利用Western blot和激光共聚焦免疫熒光等技術(shù)證實，SVA 2C蛋白能夠獨立誘導(dǎo)線粒體自噬。借助免疫共沉淀配合質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)，2C蛋白通過與線粒體蛋白質(zhì)翻譯延伸因子（TUFM）相互作用誘導(dǎo)線粒體自噬。通過構(gòu)建2C和TUFM蛋白系列截短體并利用免疫共沉淀證實，2C蛋白第231?321位氨基酸與TUFM蛋白第56?252位氨基酸所在區(qū)域是兩者互作的關(guān)鍵區(qū)域，其中TUFM蛋白第196和211位谷氨酸（E196和E211）是決定兩者互作的關(guān)鍵位點（圖2）。

圖2. SVA 2C蛋白與線粒體TUFM蛋白互作關(guān)鍵區(qū)域和位點的鑒定

通過構(gòu)建攜帶不同標(biāo)簽的泛素和TUFM真核表達(dá)質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，借助免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)TUFM在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生泛素化修飾，且SVA感染可顯著增強TUFM泛素化水平，只有泛素化修飾的TUFM才能與p62發(fā)生互作，而p62又與LC3存在互作。以內(nèi)源性TUFM為誘餌，利用免疫共沉淀配合質(zhì)譜鑒定，證實RNF185是催化TUFM泛素化修飾的關(guān)鍵E3泛素連接酶。通過構(gòu)建系列截短體和突變體發(fā)現(xiàn)，RNF185通過其TM1結(jié)構(gòu)域與TUFM互作，催化TUFM發(fā)生K27鏈泛素化修飾（圖3）。

圖3. RNF185與TUFM互作關(guān)鍵區(qū)域以及TUFM泛素化修飾類型的鑒定

綜上，該研究證實了SVA感染通過誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生線粒體自噬促進(jìn)病毒復(fù)制，SVA 2C蛋白通過與RNF185催化的K27鏈泛素化的TUFM直接相互作用誘導(dǎo)線粒體自噬發(fā)生（圖4）。該研究豐富了對SVA致病機制的認(rèn)識，并為新型抗病毒策略設(shè)計提供了線索。

圖4. SVA感染誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體自噬促進(jìn)自身復(fù)制的分子機制模式圖

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院張永寧副教授和楊漢春教授為文章通訊作者，博士研究生陳美榮為第一作者。該研究得到國家自然科學(xué)基金面上項目（32072840）、北京市自然科學(xué)基金面上項目（6212013）和國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-35）等項目的資助。