在研項目

犬貓作為人類伴侶動物,備受人們喜愛,同時在疫病方面受到越來越多的關注。犬瘟熱和犬細小病毒病是犬常見的傳染病,臨床上都表現(xiàn)為高熱、嘔吐和腹瀉等相似癥狀犬冠狀病毒病是一種急性、腸炎型傳染病,鑒別診斷與以稀便為主的腸炎疾病相似,尤其區(qū)分輪狀病毒或細小病毒感染,這些具有相似癥狀的傳染病給診斷帶來了困擾。貓杯狀病毒常引起貓科動物上呼吸道癥狀和口腔潰瘍,具有較高的感染率,目前還未研制出有效的疫苗,該病原嚴重威脅貓的健康。引起貓呼吸道疾病的另一常見病原是皰疹病毒,患病貓常出現(xiàn)發(fā)熱,打噴嚏,鼻、眼中流出分泌物等臨床癥狀,主要威脅仔貓的健康,發(fā)病率可達100% 。貓泛白細胞減少癥又稱貓瘟熱,是由細小病毒引起的傳染病,幼貓的感染率和死亡率較高,白細胞顯著減少是患該病的一個重要特征。此外,大腸桿菌和結核分枝桿菌等引發(fā)的細菌病以及弓形蟲、旋毛蟲、鉤端螺旋體等寄生蟲病,都是威脅犬貓健康的重要病原。其中,部分疫病為人畜共患病,如狂犬病、弓形蟲病和鉤端螺旋體病等,存在病原的跨物種傳播的風險,對人類公眾健康構成了重大威脅。 因此,建立早期快速而準確的檢測方法,對控制犬貓疾病的流行具有重要意義。

盡管病原體的分離和鑒定是診斷的金標準,但是某些病原為人畜共患病原體存在安全隱患,因此,在寵物門診和醫(yī)院實施較為困難。隨著分子生物學診斷技術的進步,相關檢測技術不斷優(yōu)化,出現(xiàn)操作簡單、靈敏度高、特異性強的新型檢測技術, 如實時熒光定量PCR技術、等溫擴增技術和基因芯片等核酸檢測技術,膠體金免疫層析技術、時間分辨熒光免疫層析技術、熒光微球免疫學檢測技術、化學發(fā)光免疫分析技術和免疫生物傳感器等免疫學檢測技術和基于CRISPR/Cas的核酸檢測系統(tǒng)等其他新型檢測技術,可以滿足在多種環(huán)境下快速檢測病原的需求,本文現(xiàn)針對犬貓主要病原的新型檢測技術的應用和研究現(xiàn)狀作以下總結概述。

聚合酶鏈式反應（Polymerase chainreation, PCR）技術主要針對病原基因組高度保守的序列,將微量的核酸分子進行大量擴增,是現(xiàn)代應用較為廣泛的病原檢測手段之一,但是也存在缺點,需要提取樣品DNA,并且檢測結果只能依賴于凝膠電泳的定性分析。實時熒光PCR系統(tǒng)可以滿足定量分析,目前,已經(jīng)建立了貓星狀病毒、犬流感病毒、犬肝片吸蟲、犬鉤蟲和犬鉤端螺旋體等多種常見犬貓病原的實時熒光定量PCR方法。該技術是寵物醫(yī)療檢測平臺的首選技術,但由于檢測結果需要依賴于昂貴的儀器設備,且對操作人員有一定要求,所以只能在設備全面的實驗室中進行。此外,基于PCR反應原理,衍生出操作簡單的等溫擴增技術和可實現(xiàn)高通量的基因芯片技術等。

1.1環(huán)介導等溫擴增技術

環(huán)介導等溫擴增技術(Loopmediated isothermal amplification,LAMP) 是由日本學者Notomi等建立的體外恒溫擴增核酸的技術,1h之內即可對靶基因進行高效擴增。

國內外已有利用LAMP技術進行檢測的報道。關瑋琨等根據(jù)犬細小病毒（Canine parvovirus,CPV）VP2基因設計引物建立了LAMP方法,最低檢出量為2.1×10^-２TCID₅₀,敏感性是PCR技術的100倍,在臨床樣品進行檢測中,其與PCR檢測結果符合率達100% 。目前,已有犬細小病毒、犬瘟熱病毒和貓泛白細胞減少癥病毒等LAMP的檢測方法,該技術還運用到犬馬鞭毛蟲、犬帶絳蟲、犬孢子蟲等多種犬寄生蟲病的檢測。值得注意的是,LAMP技術已經(jīng)廣泛應用于食源性致病菌的檢測,但在犬貓細菌性疾病檢測研究較少。相比于普通PCR,LAMP技術只需要簡單的恒溫水浴即可完成對微量病原的高效擴增,但是還未出現(xiàn)檢測犬貓病原的商品化試劑盒。該技術尚有設計引物較難的缺點,引物之間常存在二聚體結構,進而導致結果的假陽性。

1.2重組酶聚合酶擴增技術

重組酶聚合酶擴增 (Recombinase polymerase amplification, RPA) 是Piepenburg等于2006年研發(fā)出的核酸等溫擴增技術。該技術主要依賴于多種酶和蛋白參與,通過模擬DNA體內擴增,以實現(xiàn)DNA特定區(qū)域的指數(shù)擴增。

近年來,許多研究工作都報道了應用RPA技術實現(xiàn)對病原快速且靈敏的檢測。Wang等針對犬瘟熱病毒核衣殼基因設計三種引物和探針,篩選后選出最佳組合,建立RPA快速檢測方法,該方法與實時RT-PCR診斷符合率為100%,但相比之下,RPA方法更加省時方便,檢測時間為3~12min 。Hu等建立貓冠狀病毒的RPA檢測方法,在39℃條件下,15min即可特異性檢測出該病毒的膜基因,最低檢測限為233拷貝。目前,已建立起貓皰疹病毒、狂犬病病毒和犬細小病毒等RPA檢測方法,結果均具有較高的靈敏性和特異性,但目前尚未有關于犬貓病原檢測的RPA產品完成研發(fā)與上市。RPA技術的優(yōu)勢主要在于體外37~42℃恒溫擴增,反應時間只需5~20min,可以實現(xiàn)及時準確的檢測。該技術還存在不足,如沒有專門的軟件設計引物和探針,只能通過消耗大量的時間和成本,篩選效果良好的引物和探針。此外,RPA擴增后需要對其進行純化,否則在瓊脂糖凝膠電泳時會導致結果模糊。

1.3基因芯片技術

基因芯片又稱DNA微陣列,基于核酸雜交技術原理將靶基因固定到固體支持物上,隨后將處理后的樣品與靶基因進行特異性結合,以實現(xiàn)對所測樣品基因的大規(guī)模定量檢驗,因其高通量的特點而被應用于各個領域。

基因芯片技術不僅能區(qū)分多種病原的種屬,甚至可以同時跨物種檢測,極大的縮短了操作時間。李健等建立了犬冠狀病毒、貓冠狀病毒和貓傳染性腹膜炎病毒的三種病毒的基因芯片技術,為病原的快速檢測提供了便利。Wu等利用芯片技 術原理同時檢測五種犬病毒,這些病毒包括犬瘟熱、犬細小病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒和狂犬病病毒,通過靶向每種病毒的保守基因組區(qū)域來實現(xiàn)測定特異性,對臨床75個樣本進行檢測,結果顯示與普通PCR技術檢測結果的符合率為100%。基因芯片檢測病原技術成功的關鍵在于提高雜交特異性和降低干擾背景,但其檢測結果多依賴于專業(yè)掃描儀器,成本較高。目前,該技術在犬貓疫病檢測方面尚處于實驗研究階段。

由于病原標識性抗原篩選技術、單克隆抗體、多克隆抗體以及重組抗體等生物技術的快速發(fā)展,使得基于抗原抗體特異性結合的免疫學診斷技術,以膠體金作為指示劑的層析技術,可以實現(xiàn)對待測 樣品的直觀快速的檢測,已研究出犬細小病毒、犬貓弓形蟲 、貓冠狀病毒和貓泛白細胞減少癥病毒檢測試紙條,根據(jù)國家獸藥基礎數(shù)據(jù)庫查詢可知,目前已有約13種已經(jīng)批準上市的犬貓膠體金檢測試紙條,由于操作簡單,結果只需肉眼觀察,被寵物醫(yī)院和基層單位的現(xiàn)場廣泛使用,但膠體金免疫層析試紙條檢測病原只能定性或是半定量,且準確性低于PCR技術。在此基礎上,新的免疫學檢測技術相繼出現(xiàn),如時間分辨免疫分析技術、免疫微球檢測技術、化學發(fā)光免疫分析技術和免疫生物傳感器等。

2.1時間分辨免疫熒光層析技術

時間分辨免疫熒光層析技術(Time-resolved immunochromatographic fluorescent assay,TRIFA)是基于免疫層析和時間分辨熒光分析相結合的定量檢測技術,利用熒光的鑭系元素或稀土粒子標記抗原或抗體,使抗原抗體在硝酸纖維膜上發(fā)生反應,用簡單配套的設備來測定熒光強度,從而實現(xiàn)定量分析待測樣本中的濃度。

TRIFA技術的主要標記物為鑭系元素,因其特殊的發(fā)光特性可以有效減低外界熒光和非特異性熒光的干擾,增強檢測的靈敏度。Chen等將犬細小病毒抗體與銪(Eu³⁺) 偶聯(lián)標記,建立雙抗體夾心式的時間分辨免疫層析技術以檢測犬細小病 毒的含量,靈敏度達1.15mEu/mL。韓陽瑞等建立了檢測弓形蟲感染的血清中抗體的時間分辨免疫層析技術,結果通過統(tǒng)計學的分析,顯示該方法與ELISA之間具有較好的一致性,且具有足夠的精度、分析靈敏度和準確度。我國已有研究人員基于TRIFA技術對犬冠狀病毒和貓杯狀病毒實現(xiàn)定量檢測,但未有針對犬貓病原檢測的商品用試劑盒。該技術既保留了膠體金免疫層析技術的反應快速、操作簡單的特點,通過熒光技術實現(xiàn)了對試驗結果的定量分析,但是實驗結果的熒光信號需依賴于配套的儀器設備。

2.2免疫微球分離檢測技術

免疫微球分離技術(Immunomagnetic beads separation technology,IMBS）是將磁珠的磁性、響應性和抗原抗體的特異性反應相結合的一項技術,將特異性抗原(或抗體)偶聯(lián)在磁性微球表面,從而與待檢樣品的抗體(或抗原)特異性結合,達到分離濃縮的目的。

IMBS主要與其他檢測技術相結合以避免樣品中的其他成分對檢測的干擾,使檢測結果更加高效、特異。唐毓等利用表達并純化的犬細小病毒中VP2基因的重組蛋白作為抗原與納米微球偶聯(lián),建立了一種快速檢測犬細小病毒抗體的間接凝 集方法,對臨床40份犬血清進行檢測,結果顯示,不僅檢測時間比ELISA用時短,而且與ELISA檢測方法的符合率達97%。Chen等將磁珠免疫微球技術和化學發(fā)光層析技術相結合建立檢測犬血 清中的犬細小病毒抗體的方法,1h通過采集光度即可分析結果,可運用該方法定量檢測犬細小病毒抗體的濃度和疫苗免疫效果的評價。相較于傳統(tǒng)的免疫學診斷技術，該技術可實現(xiàn)免疫分離與微量富集結合為一體,降低非特異性結合可能性,使檢測結果更加高效、特異。使用IMBS進行高效富集的關鍵在于抗體的特異性和敏感性,但是受到樣品基質的復雜性生物干擾,因此,IMBS的應用性能還需要進一步研究。

2.3化學發(fā)光免疫分析技術

化學發(fā)光免疫分析技術(Chemiluminescence immunoassay,CLIA)是以化學發(fā)光相關物質為示蹤信號標記抗原(或抗體), 利用抗原抗體特異性結合的原理，通過化學發(fā)光強度對待測物定量分析。由于發(fā)光強度與待測物的濃度呈正相關,可以通過儀器測定發(fā)光強度,便可對待測物進行定量分析。

吖啶酯是常見的化學發(fā)光物質,其發(fā)光效率在1s內即可完成,成本低,適合各種檢測機構使用。Gasior等將吖啶酯與二抗(IgG)和SAG2-GRA1-ROP1L嵌合抗原連接起來，建立檢測血清中弓形蟲特異性抗體的化學發(fā)光免疫分析方法,以ROC曲線來分析的IgG CLIA與IgG ELISA測定的診斷價值，使用相同用量的二抗測得AUC(ROC曲線下的面積)的結果分別是0.966和0.985,結果表明,IgG CLIA比IgG ELISA的檢測結果更加敏感。Chen等利用犬細小病毒重組蛋白為包被抗原,以吖啶酯標記二抗,建立檢測犬細小病毒抗體的CLIA檢測方法,1h后即可收集化學發(fā)光強度,檢測限為0.36ng/mL。楊富強等利用堿性酶對犬瘟熱病毒抗原進行標記,以吖啶酯類作為發(fā)光底物,設計并發(fā)明檢測犬瘟熱病毒抗體。該方法具有即時 診斷特點,37℃孵育半小時即可。其在靈敏度、穩(wěn)定性和檢測效率上明顯優(yōu)于ELISA測定方法。雖然該技術目前在犬貓病原檢測方面未有面向市場的產品，但在2021年完成了第一個動物用化學發(fā)光試劑盒的審批注冊,該技術不需要外界的激發(fā)光源,降低了背景的熒光信號,可以在較寬的線性范圍檢測極低濃度的樣品,具有較高的敏感性,但是其檢測結果依賴于專業(yè)的實驗設備和對操作人員具有一定的要求,因此,在基層推廣還是有一定限制。

2.4 免疫生物傳感器

生物傳感器是分子生物學、電化學、微生物學等多學科相互滲透的新型技術,由分子識別元件即敏感元件(如酶、抗原、細胞器、核酸、細胞受體、生物膜等)和信號轉換器(如半導體、光電轉換、熱敏電阻、壓電晶體等)組成,可以與靶標物質發(fā)生生化反應并且將其濃度轉換為可測量的電信號或光信號,達到定量定性分析的目的。

生物傳感器的種類眾多,其中免疫生物傳感器在病原檢測方面是可靠手段,具有特異性、長期穩(wěn)定性、快速反應性等特點。Jiang等先將硫氨酸在nafion-石墨烯修飾的電極上電聚合形成生物敏感膜,在膜上固定弓形蟲特異性抗原,基于雙抗體夾心法的原理,構建了一種用于檢測弓形蟲特異性IgM的新型電化學免疫傳感器,結果表明,電流與IgM濃度具有正相關性,檢測限為0.016AU/mL(S/N=3)。Kim等設計出檢測犬細小病毒的石英晶體微天平生物傳感器,將特定抗體嵌合在金涂層的石英晶體表面,通過抗原抗體相結合的頻率變化以檢測犬細小病毒的含量。該生物傳感器具有納米級的敏感度,通過對臨床261份糞便樣本分析,結果顯示,與PCR相比,具有95.4％的敏感度和98％的特異性?；诿庖邔W的生物傳感器技術具有特異、靈敏、快速的優(yōu)勢,但是也存在缺點,如抗體結合到生物傳感器易失活,穩(wěn)定性較差；非特異性吸附會影響結果的準確性等。目前針對犬貓病原檢測的免疫生物傳感器方法仍停留在科研實驗室階段，還未出現(xiàn)可應用的商品。

成簇規(guī)律間隔的短回文重復序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)以及相關蛋白（CRISPR-associated protein,Cas）組成的CRISPR/Cas系統(tǒng)是廣泛存在于古細菌和細菌中的獲得性免疫系統(tǒng),用于抵御外來病毒的入侵。由于CRISPR/Cas系統(tǒng)具有較高特異性和靈敏度,可作為新型的核酸檢測平臺,其中Cas蛋白作為高特異性的序列識別靶標元件,可以與信號讀取方法相結合,進行核酸的定量檢測。

基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的核酸檢測方法主要由三個步驟構成,包括核酸擴增、特異性核酸序列識別以及檢測結果讀取。Khan等將重組酶介導的擴增技術與CRISPR/Cas13a檢測系統(tǒng)相結合,建立快速、特異檢測犬細小病毒的熒光報告系統(tǒng),該系統(tǒng)可在30min內檢測到100amol/LCPV-2DNA。該方法具有較高的特異性,通過與其他犬類病毒(犬瘟熱病毒、犬冠狀病毒、犬副流感病毒)進行檢測,結果顯示,犬細小病毒的平均熒光值顯著更高。CRISPR/Cas系統(tǒng)可以與熒光信號、免疫層析試紙條等方法相結合,便可實現(xiàn)現(xiàn)場操作,可在寵物醫(yī)院和大型養(yǎng)殖場推廣使用。但該技術還存在缺點：如脫靶效應,可能會在檢測過程中出現(xiàn)假陽性的結果；RNA 酶廣泛存在,可能會使CRISPR檢測體系的重要組分向導RNA被降解,影響檢測 結果的穩(wěn)定性。目前該系統(tǒng)在人類疾病領域出現(xiàn)商品化診斷試劑,但在犬貓病原檢測研究尚少。

近年來,各種新型檢測技術在準確度、靈敏度及操作時間都有跨越式發(fā)展,但大多數(shù)的核酸檢測技術依賴精密甚至昂貴的儀器設備和專業(yè)的操作人員,不能在基層大規(guī)模普及。鑒于熒光檢測系統(tǒng)和側向流動分析技術可提供一個簡單的可視化結果分析,因此可以考慮將多個技術聯(lián)合使用,發(fā)揮各技術的優(yōu)勢,從而實現(xiàn)優(yōu)勢互補以實現(xiàn)快速、敏感的檢測。在免疫檢測技術中,標記物是影響靈敏度和檢測效率的重要因素,與傳統(tǒng)的基于金納米顆粒標記相比,使用彩色微球、量子化、鑭系元素和膠體碳等新型材料標記可以進一步提高靈敏度和檢測效率,可能使得免疫層析技術更快速、靈敏、準確,在犬貓病原檢測方面具有良好的應用前景。尤其是近年來,成熟應用于人類臨床醫(yī)學的化學發(fā)光免疫層析技術,已開始在動物疫病檢測方面從研究走向市場,未來就需要有條件的企業(yè)或科研平臺加大科研投入,以促進成果轉化,相信在犬貓病原檢測方面將會有巨大的市場。

隨著科技學技術的發(fā)展,檢測的智能化、數(shù)字化和便攜化趨勢越來越明顯,快速、高效、準確的快速檢測方法是犬貓等動物檢測的發(fā)展趨勢。人工智能提供了一個準確分析數(shù)據(jù)的平臺,高分辨率的攝像頭和精確的計算能力,可彌補目測帶來的不準確性,實現(xiàn)對病原含量客觀、精準的閱讀,減少操作人員的主觀錯誤判斷。

同時,多種病原同步檢測技術也是臨床檢測的發(fā)展趨勢,尤其是對于處于潛伏期感染的動物,需要在疾病發(fā)生早期進行病原篩查,這就需要實現(xiàn)多種病原的多重擴增,對寵物病原來講,目前仍然是一個挑戰(zhàn)。

未來,犬貓等寵物病原檢測技術會朝著多種檢測技術互相融合、高通量、高靈敏度、高準確度、快速檢測、可普及推廣及可商品化的方向發(fā)展,以便滿足在不同檢測環(huán)境下的快速檢測,為犬貓的健康和公共生物安全保駕護航。